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[2023] [생화학실험] RNA polymerase 분리 정제

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작성일 23-02-07 16:09

본문

고농도의 염 용액 속에서는 Protein은 뭉쳐서 침전하는 경향이 있따 이러한 기술을 Salting Out(Salting out effect - Protein은 구조상 hydrophobic한 부분은 분자의 내부에 위치하고 hydrophilic한 부분은 분자의 밖에 위치하여 물과 결합되어 안정을 유지한다. ② 잘 섞은 pellet을 ice에 박혀있는 비커에 붓고 stirring하여 6ml lysozyme에 분주한 다음, 66ml PMSF와 33ul leupeptin도 첨가한다.) ③ 20min 후, 3ml 0.8% Sodium deoxycloate 첨가하고 20min 반응 시간 준다.
자란 cell을 통해 원하는 T7 RNA polymerase가 생겼는지 확인하기 위하여 먼저 cell lysis를 한다. DTT는 DNA를 석출시키는데 사용되며 더 완벽한 용해를 위하여 sodium deoxycholate을 첨가한 뒤 centrifuge하면 원하는 단백질이 supernatant에 녹아 있게 된다.
③ 20min 후, 3ml 0.8% Sodium deoxycloate 첨가하고 20min 반응 시간 준다.

순서

PEI는 많은 branch ed orgarnic polymer를 가지고 있따 각 branch마다 질소 원자가 포함되어 있어 상당히 높은 양전하를 띄게 되는데, 이렇게 높은 질소 원자의 분포는 다양한 구조를 가지지게 되고 또한 완충 작용을 해주므로 다양한 pH에서 안정적이다. ⑧ supernatant만 비커에 담고 전체 volume의 0.82배(46ml) ammonium sulfate를 천천히 첨가시켜 15min 반응시킨다. ⑦ 39.00g 4도에서 15min ultra centrifuge한다. ④ 20min 후, 50ul PMSF 첨가하고 5.6ml 2M Ammonium Sulfate 첨가한다. ④ 20min 후, 50ul PMSF 첨가하고 5.6ml 2M Ammonium Sulfate 첨가한다.

⑦ 39.00g 4도에서 15min ultra centrifuge한다.
④ Ammonium sulfate
① pellet을 녹인 후 Buffer LB 26ml 분주하여 섞는다.
설명
⑤ Total volume 56ml 까지 Buffer LB를 첨가한다. Buffer LB(EDTA 포함)와 lysozyme, PMSF, leupeptin을 첨가하면 EDTA가 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 한다.
⑧ supernatant만 비커에 담고 전체 volume의 0.82배(46ml) ammonium sulfate를 천천히 첨가시켜 15min 반응시킨다.)
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[생화학실험] RNA polymerase 분리 정제

⑥ Sephadex

RNA polymerase 분리 정제,RNA polymerase
⑤ PEI
세균 Leucostoc nesebteriodes 가설탕에서 합성하는 덱스트란(분지하는 D-포도당 중합체로 주사슬은 α1→6결합, 분기점은 α1→3결합으로 구성된다)을 에피클로로히드린으로 가교하여 비즈모양으로 성형한 친수성겔. 화학적으로 안정하며, 흡착이 적고 저압에서의 겔여과에 최적인 겔로서 널리 사용하고 있따 G-10부터 G-200까지 가교도의 차이에 따라 여러 가지 종류가 있따 이들 분획범위는 전체적으로 펩티드, 단백질에 대해 분자량이 수백에서60만에 이른다.

⑥ 5.6ml 10% PEI를 아주 천천히 넣어주고 20 min 반응시간 준다. ⑥ 5.6ml 10% PEI를 아주 천천히 넣어주고 20 min 반응시간 준다. 이 때, 세포의 형태를 유지하기 위하여 lysozyme도 함께 넣어주고, 단백질이 분해되지 않도록 PMSF와 leupeptin도 넣어준다. ⑤ Total volume 56ml 까지 Buffer LB를 첨가한다.
② 잘 섞은 pellet을 ice에 박혀있는 비커에 붓고 stirring하여 6ml lysozyme에 분주한 다음, 66ml PMSF와 33ul leupeptin도 첨가한다.

Download : [생화학실험] RNA polymera.hwp( 93 )

다. (20min 반응시간 준다. 여기서 Ammonium Sulfate는 염의 종류로 침출 결과 , pH의 다양성, 고도의 용해성, 용액의 저열, 저가 등과 같은 많은 유용한 특성들과 연관되어 있따

① pellet을 녹인 후 Buffer LB 26ml 분주하여 섞는다. (20min 반응시간 준다.

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